当细胞达到汇合80-90%时，必须对其进行传代培养或传代。未能传代培养汇合细胞会导致有丝分裂指数降低并最终导致细胞死亡。传代培养的第一步是通过胰蛋白酶消化或机械手段将细胞从原代培养容器表面分离。小伙伴们在给贴壁细胞传代的时候有没有遇到细胞消化不下来的情况呢？有时候等了10分钟甚至20分钟细胞仍不动，继续等待怕消化过度，暴力吹下又怕对细胞造成机械损伤，可谓进退两难。我们先来了解下消化的作用机制：

一、 消化作用的分子基础‌

1.胰酶的核心作用机制‌

胰蛋白酶作为丝氨酸蛋白酶，特异性切割精氨酸和赖氨酸的羧基端肽键，通过水解作用破坏以下关键结构：

细胞外基质（ECM）‌：降解纤连蛋白、层粘连蛋白等贴附支架蛋白；

细胞间连接蛋白‌：切割钙黏蛋白和整合素，解除细胞-基质及细胞-细胞间的黏附。

辅助试剂EDTA通过螯合Ca²⁺/Mg²⁺离子，削弱整合素与ECM的结合，提升胰酶效率。

2.离子螯合剂的协同效应‌

0.02% EDTA通过剥夺细胞表面依赖钙/镁离子的黏附蛋白（如桥粒、钙黏着蛋白），使细胞连接失活而不损伤膜蛋白结构，适用于表面分子检测实验。

‌二、消化过程的分阶段动态变化‌

1.初始裂解阶段‌

胰酶渗透细胞层，切割ECM蛋白，细胞边缘开始卷曲，贴附力下降；

2.连接破坏阶段‌

钙黏蛋白降解导致细胞间连接松开，单层细胞分裂为小片状；

3.完全脱落阶段‌

细胞形态由铺展转为圆形，最终脱离培养表面（需37℃恒温加速反应）。

‌三、终止反应的生化原理‌

血清终止法‌：含血清培养基中的α-1抗胰蛋白酶可不可逆抑制胰酶活性；

‌清洗终止法‌：PBS冲洗去除残留胰酶，避免过度消化损伤细胞膜受体。

以下总结了细胞难消化的原因，以及对应的处理方式：

1.细胞贴壁紧

不同种类的细胞贴壁的松紧程度是不一样的，比如293系列细胞贴壁很松，是晃一晃就可能掉下来的程度。而MCF10A、IBMDM等巨噬细胞系贴壁很紧，可能需要消化5-10min甚至更久才能脱落。在培养一株细胞之前，可以问问有经验的科研人员或者上网查资料或者从细胞来源处确认这株细胞大概消化多久，才能更好完成消化步骤使细胞保持最佳状态。

还有不规则形态细胞存在更多贴附位点，需增加胰酶用量至完全覆盖细胞层才能达到消化的目的。如：

解决方案：若您培养的细胞贴壁较紧，参考以下步骤1.增加消化时间，常规细胞消化时间为1-3min，难消化的细胞需要5-15min甚至更长。 2.提高胰酶的浓度，常用浓度为0.25%，可提高到0.5%；3.加入足量的胰酶至没过细胞，37℃消化；使用含有EDTA的胰酶，具体请以镜下观察到细胞变圆脱落为准。（常用的培养器皿推荐胰酶添加量）

小技巧：在消化贴壁较紧的细胞有个小技巧，就是消化到细胞要脱落的时候先不终止，先吸胰酶轻轻吹下细胞，大部分细胞脱落后再加终止液。贴壁太强的细胞，先加终止有时候会很快贴壁回去导致消化其实细胞已经要脱落了，但一加终止液就贴回去的情况。

注:如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化:

① 准备一个无菌的 15ml 离心管，加入 2ml含 10%FBS 的完全培养基;

② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和(避免吹打);

③ 向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入 2ml含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。

比如：bEnd.3细胞培养时间越长越难消化，培养4d传代，一般消化3~5 min；培养7d传代，一般消化5~10 min。具体消化时间以显微镜下观察细胞状态为准。

2.有残留血清

　　血清中的某些蛋白质（如α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白）对蛋白酶有强烈的抑制作用。如果PBS清洗不彻底，胰酶将不能发挥作用。

　　解决方案：若在消化途中发现因清洗不彻底而无法消化下来，吸去培养器皿中的胰酶（如果已有部分细胞脱落，将已脱落细胞转移至离心管），向培养器皿中加入足量PBS重新润洗30s，弃去PBS再加入新的胰酶来重新消化。

3.胰酶量过少/浓度低/消化温度低

　　有的小伙伴习惯用胰酶清洗细胞后去掉大部分胰酶，用剩余的胰酶继续消化，这对于贴壁松的细胞是可以的，但该方法并不适用于贴壁紧的细胞。胰酶量太少无法将贴壁紧的细胞消化彻底。胰酶的最适温度是37℃，有一种常用策略是室温消化，当温度低于37℃时胰酶活性低，室温环境消化还可以放在显微镜下边看边消化，更容易把握消化进度。但仍然需要注意这适用于贴壁较松且比较脆弱的细胞，对于贴壁紧的细胞室温下是很难消化下来的，甚至可能因消化时间过长对细胞产生伤害。常见的胰酶浓度有0.125%，0.25%和0.5%。常规细胞系多用0.25%胰酶，而对胰酶敏感的较脆弱的细胞可使用0.125%胰酶消化。应根据细胞的贴壁特性和胰酶耐受程度，使用不同浓度的胰酶。

　　解决方案：根据细胞贴壁特性选择合适的胰酶使用量、浓度和消化温度。

4.胰酶失活

　　胰酶开封久了活性会降低甚至彻底失活，所以小伙伴们可以根据需要将开封的胰酶分装到离心管中，将暂时不用的部分放在-20℃冰箱冷冻，放在2-8℃冷藏的胰酶也要尽早使用完毕哦。

　　解决方案：若发现胰酶开封太久，建议使用新的胰酶进行消化。

5.胰酶品牌差异

　　胰酶通常来自牛或猪的胰腺，不同厂家的提取加工工艺不同，所生产的胰酶消化时间差别较大。

　　解决方案：从不同厂家获取胰酶试用装，找到最适合自己细胞的胰酶品牌。

6.细胞密度过大或长时间不传代

　　细胞密度过大，造成细胞拥挤或者堆叠时细胞将变得更难消化。另外，细胞长时间培养不传代也有可能使细胞贴壁变紧。

解决方案：若出现上述情况，可增加胰酶的用量，并适当延长消化时间，直到细胞能够脱落。

7. 增加胰酶的用量，延长消化时间，用常规方法细胞仍消化不下来，如何处理？

解决方案：若出现上述情况，先判断细胞消化前的状态是否正常，若细胞形态异常，出现老化或分化现象，贴壁就会异常牢固，用常规方法消化不下来。可尝试用刮刀将细胞刮下来，离心传代后观察细胞状态，若细胞形态状态仍异常，建议丢弃，重新复苏其他批次。